本发明涉及一种测定海洋贝类抗氧化能力的方法，具体说是一种快速测定海洋双壳贝类总抗氧化能力的方法。本发明利用96孔酶标板的全波频扫描型酶标仪代替常规的分光光度计测定处理后样品的总抗氧化能力，能够在极短的时间内，对批量样品进行快速、准确的测定，从而为海产双壳贝类的种间抗性研究提供一个快速检测方法。利用本发明可在极短的时间内批量测定海产双壳贝类不同种类、不同组织的总抗氧化能力，测定速度比常规方法提高10倍左右。
1.一种快速测定海洋双壳贝类总抗氧化能力的方法，包括下列步骤：(1)建立Trolox标准曲线：①精确称取Trolox[(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylicxa0acid]，用95％乙醇配制母液，并稀释成梯度浓度，然后取等量体积溶液加入不同的试管中再分别加入3倍的蒸馏水和30倍的FRAP工作液，其中FRAP工作液由0.3M醋酸盐缓冲液:10mMxa0TPTZ溶液:20mMFeCl₃溶液＝10:1:1体积比例混合，用前半小时临时配制，建成Trolox反应体系，同时以95％乙醇代替Trolox溶液作为对照；②37℃水浴30min后，立即以冰水浴终止反应；③然后吸取每份混合物200μl，用全波频扫描型酶标仪在593nm处测定其吸光值并计算出标准曲线；(2)建立蛋白质定量标准曲线：①精确称取标准牛血清蛋白，用蒸馏水配制母液，并稀释成梯度浓度，然后取等量加入不同的试管中再加入5倍体积的0.1g/L考马斯亮蓝-G250染液；②混匀并静置5min，然后吸取每份样品200μl，用全波频扫描型酶标仪在595nm处测定其吸光值并计算出标准曲线；(3)组织取样：分别对活的双壳海产贝类的闭壳肌、鳃、外套膜等组织进行取样，并以预冷的生理盐水，浓度为0.86％，清洗所取组织样品，整个过程在冰上进行；(4)样品处理：各组织样品初步粉碎并搅拌均匀后，分别称取一定量的组织样品于离心管中，加入体积为样品质量9倍的PBS缓冲液，在冰水浴条件下以10000-15000r/min转速进行匀浆，之后以12000g于4℃下离心10min，取上清液并稀释到所需的浓度后备用；所述PBS缓冲液与组织样品的体积质量比的单位为ml/mg；(5)待测样品Trolox浓度的测定：以待测样品上清液代替步骤(1)中的Trolox溶液，其余操作同步骤(1)，然后将吸光值转化为Trolox浓度，单位为μM并定义为C₁；(6)待测样品蛋白质浓度的测定：以待测样品上清液代替步骤(2)中的标准蛋白质溶液，其余操作同步骤(2)，然后根据蛋白质定量标准曲线计算出其蛋白质浓度，单位为μg/ml并定义为C2；(7)样品总抗氧化能力(TAC)的计算：TAC＝C₁/C₂，单位为μmol/mg，即每毫克组织蛋白相当的Trolox的微摩尔数。技术领域
本发明涉及一种测定海洋贝类抗氧化能力的方法，具体说是一种快速测定海洋双壳贝类总抗氧化能力的方法。
背景技术
总抗氧化能力(Totalxa0antioxidantxa0capability，TAC)是衡量动物清除机体内过量的活性氧自由基（Reactivexa0oxygenxa0radicalxa0species,xa0ROS）的能力，是一个综合性指标。在疾病和应激状态下，动物机体需氧量会急剧增加、代谢异常，引起氧化应激，细胞内会产生和积累大量的ROS。ROS通过与蛋白质、核酸和脂类发生作用而引起蛋白质失活甚至降解、DNA链发生断裂、脂质过氧化等，从而导致细胞结构和功能破坏，同时引发体内氧化胁迫，若不能及时清除，最终造成机体氧化损伤，严重危害机体健康，甚至导致死亡。正常情况下，细胞内ROS的产生与清除总是处于动态平衡状态。在生物系统进化过程中，动物细胞为了保护自身免受伤害也形成了一套由抗氧化酶体系（如超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT、谷胱甘肽过氧化氢酶GPx等）和抗氧化非酶体系（如类胡萝卜素、辅酶Q、硒、维生素、含巯基化合物等）内在的抗氧化防御体系，从而具有一定的抗氧化能力。因此，研究机体清除ROS的能力对其维持内环境稳定和抗逆抗病能力具有重要意义。海产双壳类是软体动物门中最重要的一个纲，其中有很多种类，如蚶、蛤、扇贝、蛏等不但具有重要的经济价值，同时也是重要的海水养殖对象。然而，迄今为止，对这些物种抗氧化能力的研究却知之甚少，仅在贻贝、蛏等个别种类上有少量的报道，而且其测定方法都是采用铁离子还原抗氧化力分析法（Ferricxa0reducingxa0antioxidantxa0power，FRAP）处理样品后，利用分光光度计来进行。这种常规的方法有几个缺点：1、耗时长。在样品处理完成后，每个样品仍需1分钟；2、用样量多。每次需要用的样品量至少2ml；3、重复性差。由于样品在空气中暴露时间长，样品重复测量值间的变化较大；4、实用性弱。每次只能够测定单个物种或少数物种，不能够批量测定、实用性弱。这种常规测定TAC的方法已远远不能满足种类繁多的海产双壳贝类科学研究的需要，因此，必须建立一种快速测定TAC的方法。迄今为止，尚未见到任何有关快速测定海产双壳贝类体内总抗氧化能力方法的报道。
发明内容
本发明的目的为了提供一种用样量少、重复性好、实用性强且快速的测定海产双壳贝类总抗氧化能力的方法。本发明利用96孔酶标板的全波频扫描型酶标仪代替分光光度计测定处理后样品的总抗氧化能力，能够在极短的时间内，对批量样品进行快速、准确的测定，从而为海产双壳贝类的种间抗性研究提供一个快速检测方法。本发明的技术方案是：利用FRAP法处理不同海产双壳贝类的不同组织，获得待测样品的上清液后，利用全波频扫描型酶标仪对其总抗氧化能力进行快速测定，其操作步骤为：1、建立Trolox标准曲线：①精确称取Troloxxa0[(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-xa0tetramethylchromane-2-carboxylicxa0acid]，用95%乙醇配制母液，并稀释成梯度浓度，然后取等量加入不同的试管中再分别加入3倍和30倍的蒸馏水和FRAP工作液（0.3M醋酸盐缓冲液:xa010xa0mMxa0TPTZ溶液:xa020xa0mMxa0FeCl₃溶液xa0=xa010:xa01:xa01比例混合，用前半小时临时配制）建成Trolox反应体系，同时以95%乙醇代替Trolox溶液作为对照；②37℃水浴30xa0min后，立即以冰水浴终止反应。③然后吸取每份混合物200xa0μl，用全波频扫描型酶标仪在593xa0nm处测定其吸光值并计算出标准曲线。2、建立蛋白质定量标准曲线：①精确称取标准牛血清蛋白，用蒸馏水配制母液，并稀释成梯度浓度，然后取等量加入不同的试管中再加入5倍体积的0.1g/L考马斯亮蓝-G250染液；②混匀并静置5min，然后吸取每份样品200xa0μl，用全波频扫描型酶标仪在595xa0nm处测定其吸光值并计算出标准曲线。3、组织取样：分别对活的双壳海产贝类的闭壳肌、鳃、外套膜等组织进行取样，并以预冷的生理盐水（0.86％）清洗所取组织样品，整个过程在冰上进行。4、样品处理：各组织样品初步粉碎并搅拌均匀后，分别称取一定量的组织样品于离心管中，加入体积为样品质量9倍的PBS缓冲液，在冰水浴条件下以10000-15000xa0r/min转速进行匀浆。之后以12000xa0g于4℃下离心10xa0min，取上清液并稀释到所需的浓度后备用。5、待测样品Trolox浓度的测定：以待测样品上清液代替步骤1中的Trolox溶液，其余操作同步骤1，然后将吸光值转化为Trolox浓度（μM，C₁）。6、待测样品蛋白质浓度的测定：以待测样品上清液代替步骤2中的标准蛋白质溶液，其余操作同步骤2，然后根据蛋白质定量标准曲线计算出其蛋白质浓度（μg/ml，C₂）。7、样品总抗氧化能力（TAC）的计算：TACxa0=xa0C₁/C₂（μmol/mg），即每毫克组织蛋白相当的Trolox的微摩尔数。本发明的优点和积极效果如下：1、需时短。在样品处理完成后，每个样品仅需10秒钟，不到常规方法的1/10；2、用样量少。每次需要用的样品量仅为200μl，不到常规方法的1/10；3、重复性好。由于样品测量快速，在空气中暴露时间短，样品重复测量值间的变化较小、重复性好；4、实用性强。能够批量地多个物种的多个组织，非常实用于种类繁多的海产双壳贝类不同组织抗氧化性的研究。本发明是一种快速测定海产双壳贝类总抗氧化能力的方法，通过这种技术可快速、高效地对不同海产双壳贝类、不同组织的抗氧化能力进行研究，对海产双壳贝类抗逆性研究具有重要的意义。
具体实施方式
1、建立Trolox标准曲线：（1）精确称取25.029mgxa0Trolox，用100mL95%乙醇配制浓度为1mM的母液，并稀释成0.2mM，0.4mM，0.6mM，0.8mM等浓度，然后均取60μl加入不同的试管中再分别加入180μl的蒸馏水和18000μL的FRAP工作液（0.3M醋酸盐缓冲液:xa010mMxa0TPTZ溶液:xa020mMxa0FeCl₃溶液xa0=xa010:xa01:xa01比例混合，用前半小时临时配制）建成Trolox反应体系，同时以95%乙醇代替Trolox溶液作为对照；（2）37℃水浴30min后，立即以冰水浴终止反应。（3）然后吸取每份混合物200μl，用全波频扫描型酶标仪在593nm处测定其吸光值并计算出标准曲线（yxa0=xa00.0007xxa0-xa00.0107，R²xa0=xa00.9983，其中y为吸光值，x为Trolox的浓度（μM））。2、建立蛋白质定量标准曲线：（1）精确称取标准牛血清蛋白100mg，用100mL蒸馏水配制浓度为1000μg/ml的母液，并稀释成100μg/ml，200μg/ml，300μg/ml，400μg/ml，500μg/ml等浓度，然后取等量加入不同的试管中再加入5倍体积的0.1g/l考马斯亮蓝-G250染液；（2）混匀并静置5min，然后吸取每份样品200xa0μl，用全波频扫描型酶标仪在595xa0nm处测定其吸光值并计算出标准曲线（yxa0=xa00.0031xxa0+xa00.0086，R²xa0=xa00.9933，其中y为吸光值，x为蛋白质含量（μg/ml））。3、待检测动物及取样：待测定的栉江珧（Atrinapectinata）、毛蚶（Scapharcasubcrenata）、台湾日月贝（Amusiumjaponicumxa0taiwanicum）、菲律宾蛤仔（Ruditapesphilippinarum）和翡翠贻贝（Pernaxa0viridis）等五种海产双壳贝类均来自于粤东海区的野生种。分别对其活体的闭壳肌、鳃、外套膜等组织进行取样，并以预冷的生理盐水（0.86％）清洗所取组织样品，整个过程在冰上进行。4、样品处理：各组织样品初步粉碎并搅拌均匀后，分别称取0.1mg的组织样品于离心管中，加入体积为样品质量9倍的PBS缓冲液，在冰水浴条件下以10000-15000xa0r/min转速进行匀浆。之后以12000xa0g于4℃下离心10xa0min，取上清液并稀释到所需的浓度后备用。5、待测样品Trolox浓度的测定：以待测样品上清液代替步骤1中的Trolox溶液，其余操作同步骤1，然后将吸光值转化为Trolox浓度（μM，C₁）。所测样品共45个（5种海产双壳贝类xa0Ｘxa03种组织xa0Ｘxa03个重复xa0=xa045个样品）共耗时3min。6、待测样品蛋白质浓度的测定：以待测样品上清液代替步骤2中的标准蛋白质溶液，其余操作同步骤2，然后根据蛋白质定量标准曲线计算出其蛋白质浓度（μg/ml，C₂）。所测样品共45个共耗时3min。7、依据公式TACxa0=xa0C₁/C₂（μmol/mg）计算样品的总抗氧化能力。5种海产双壳贝类各组织的总抗氧化能力（TAC）（μmol/mg）列于表1：表1.xa0几种海产双壳贝类不同组织的总抗氧化能力（μmol/mg）ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="552"/>本发明的Trolox标准曲线和蛋白质定量标准曲线建立后既可应用于以后的每次样品测定，并且能够在极短的时间内批量测定海产双壳贝类不同种类、不同组织的总抗氧化能力，测定速度比常规方法提高10倍左右。本发明明显具有快速、高效、准确等优点，从而为海产双壳贝类的种间抗性研究提供一个快速检测方法，对海产双壳贝类抗逆性研究具有重要的意义。